Technológia DNA čipov nielen v službách medicíny

Vďaka technológii DNA čipov dnes dokážeme sledovať v jeden okamih expresnú aktivitu tisícov génov a pomocou vhodných nástrojov môžeme namerané hodnoty dávať do súvislostí, ktoré boli nedávno nemysliteľné.

Rok 1975 sa uvádza ako rok nástupu nových biotechnológií v rámci ktorých sú aplikované nové poznatky z oblasti biochémie, genetiky a molekulárnej biológie. Technika hybridizácie DNA, ktorá vznikla v šesťdesiatich rokoch minulého storočia bola v priebehu nasledujúcich dvoch desaťročí postupne stále viac využívaná v analýze génovej expresie i pri sekvenovaní génov. Na princípe tejto metódy sa vyvinuli i biočipové technológie, ktoré predstavujú to najmodernejšie, čo súčasná molekulárna genetika ponúka. Ich hlavným prínosom je možnosť detegovať veľké množstvo rôznych DNA sekvencií v jednom pokuse oproti iným bežne používaným metódam detekcie DNA (polymerázová reťazová reakcia (PCR)), ktoré umožňujú stanovenie iba jednej alebo niekoľkých DNA sekvencií.

Princíp čipovej technológie

Princíp technológie DNA čipu (v angličtine GeneChip, DNA microarray) je pomerne jednoduchý. Úseky DNA (oligonukleotidy) alebo cDNA (úseky získané spätným prepisom mRNA) so známou sekvenciou sa ˝narazia˝ (pripevnia) na sklenenú platničku do matrice riadkov a stĺpcov (Obr. 1). Fixované DNA s predvolenými koordinátami sa označujú aj ako próby a reprezentujú konkrétny gén.

Cieľom je obyčajne zistiť, ktoré gény sú v skúmanej biologickej vzorke za určitých podmienok aktívne a ktoré naopak nie sú. Pri analýze sa čip pokryje molekulami experimentálnej DNA alebo RNA označenými pomocou fluorescenčnej farbičky (červenej alebo zelenej). Najjednoduchšou analýzou s použitím DNA čipov je diagnostika t.j. detekcia prítomnosti alebo absencie génovej aktivity. V tomto prípade s a molekuly RNA v biologickej vzorke fluorescenčne označia a inkubujú s čipom. V tomto procese (tzv. hybridizácia) si označené molekuly vo vzorke nájdu svoje „páry“ (t.j. rovnaké sekvencie) na čipe a vytvoria stabilný komplex. Ostatné, nespárované molekuly sa odmyjú. Zostávajúce fluoreskujúce komplexy detekujeme laserovým skenerom, pričom práve tieto reprezentujú gény, ktoré vo vzorke boli aktívne. Naopak, nefluoreskujúce próby zodpovedajú génom, ktoré boli v danej vzorke „vypnuté“ (http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.html).

Čipmi je možné zároveň aj porovnať dve vzorky. Prvú (napríklad kontrolu) však označujeme červenou fluoreskujúcou farbou, kým druhú (napr. od chorého jedinca) označíme zelenou. Obe vzorky sa inkubujú s čipom spoločne a celý proces až po vyhodnotenie je rovnaký ako sme už popísali. Próby (komplexy), ktoré však svietia červeno prislúchajú próbam ktoré sú aktívne iba v kontrolnej vzorke, zeleno zase iba v testovanej vzorke. Tie, ktoré fluoreskujú rôznymi odtieňmi žltej (prípadne viac do červena či zelena) sú v istej miere aktívne v oboch vzorkách pričom ich pomer je možné aj kvantifikovať (Obr. 2).

V súčasnosti existuje už niekoľko verzií usporiadania čipov v závislosti od povrchu (nylonové, plastové, sklenené alebo silikónové povrchy) alebo typu značenia vzorky (rádioaktívne, chemiluminiscenčné, fluorescenčné).

Prvý DNA čip obsahujúci kompletný ľudský genóm (3 miliardy bázových párov) mal 30 tisíc bodov, pričom každý bod obsahoval 10 tisíc bázových párov dlhú DNA. Súčasné technológie umožňujú výrobu čipov s obsahom až 60 tisíc bodov. To znamená, že z jedného pokusu, ktorý trvá pár dní, dokážeme získať informáciu až o 60-tich tisícoch nezávislých úsekov DNA (http://www.gene-chips.com/).

Aplikácia DNA čipov

V začiatkoch rozvoja tejto technológie boli DNA čipy dostupné len pre analýzu génov niekoľkých organizmov (človek, myš, rastlina arábovka), dnes sú k dispozícii špecializované čipy pre pomerne široké spektrum druhov vrátane hospodárskych zvierat či rastlín. To umožňuje štúdium bunkových mechanizmov, ktoré regulujú napríklad produkciu mlieka a mäsa u hovädzieho dobytka, či odolnosť rastlín voči rôznym druhom abiotických i biotických stresorov. Aj keď v súčasnej dobe dominuje využitie DNA čipov v základnom a aplikovanom výskume, existujú tiež prvé čipy pre rutinnú diagnostiku. DNA čipy sú predmetom záujmu mnohých farmaceutických firiem a predstavujú obrovský tržný potenciál. S ich pomocou je možné priamo predpovedať typ metabolizmu niektorých liekov a navrhnúť individuálny spôsob terapie s prihliadnutím na genetickú výbavu pacienta. Od ich aplikácie sa očakáva dramatické zníženie nákladov na vývoj nových preparátov a možnosť ekonomickej produkcie špecifických liekov pre malé skupiny pacientov. Už dnes existujú niektoré cielené lieky vyvinuté týmto spôsobom (napr. Integrilin).V blízkej budúcnosti by mali byť dostupné ďalšie špecializované čipy, ktoré umožnia detekovať predispozície k rôznym typom ľudských ochorení a prípadne podchytiť ich začiatky s veľkým predstihom. Ďalšími oblasťami využitia sú imunológia, mikrobiológia a virológia. Touto cestou by sa mala uľahčiť detekcia génových profilov vírusov a baktérií behom niekoľkých hodín. Niektoré firmy už ponúkajú špeciálne upravené zákaznícke čipy, ktoré dokážu vysledovať mutácie vo vírusoch spôsobujúcich AIDS, ďalšie podobné čipy rozpoznávajú zmeny v géne p53, ktorý spôsobuje niektoré druhy rakoviny (http://www.technologyreview.com/Biotech/12525/). Iným príkladom využitia DNA čipov je identifikácia geneticky modifikovaných organizmov v rastlinách a rastlinných produktoch.

V oblasti výskumu rastlín má nesmierny význam DNA čip, ktorý obsahuje reprezentatívne sekvencie všetkých génov Arabidopsis (jedného z modelových organizmov rastlinnej molekulárnej genetiky), ako aj čip s kompletnou sadou génov topoľa. Tieto čipy sa používajú k dôkladnému mapovaniu funkcie týchto génov za najrôznejších podmienok, pričom sa sledujú najrozmanitejšie aspekty ako vplyv globálneho otepľovania na rastliny z rôznych ekosystémov, mapovanie genetickej diverzity, či vplyv rôznych environmentálnych faktorov. Nesmiernou výhodou pre konštruktérov DNA čipov je centrálna genetická banka, kde sa ukladajú výsledky výskumu všetkých laboratórií, ktoré sa zameriavajú na dekódovanie rôznych génov. Pomocou počítačov a internetu sú výrobcovia čipov schopní ihneď vložiť do čipov najnovšie dekódované sekvencie sledovaného genómu.

Technológia DNA čipov sa začína pozvoľna rozvíjať aj na Slovensku. Vývojom a aplikáciou tejto novej oblasti molekulárnej genetiky sa zaoberá niekoľko pracovísk Akadémie vied SR, univerzitných ústavov i výskumných centier fakultných nemocníc. Na Ústave molekulovej biológie SAV v Bratislave vyvinuli napr. prvú microarrayovú metódu umožňujúcu diagnostiku pôvodcov kliešťami prenosných ochorení (Blaskovic a Barák, 2005) a testujú tiež virulenciu a rezistenciu baktérií rodu Salmonella voči rôznym antibiotikám (Majtan a kol., 2007). Vplyv sucha ako aj rôznych ťažkých kovov na rastliny sa sleduje pomocou už spomínaného topoľového čipu na rakúskom Výskumnom ústave v Seibersdorfe v spolupráci s Ústavom genetiky a biotechnológie rastlín SAV v Nitre.

Širšie zavedenie čipovej technológie do klinickej praxe je otázkou blízkej budúcnosti. Pred úspešným zavedením akejkoľvek novej technológie však musí byť uskutočnená celá rada testov zameraných na presnosť, správnosť a citlivosť metódy. Je pochopiteľné, že každá metóda či technológia má aj svoje nevýhody. DNA čipy nie sú výnimkou. Úskalím technológie DNA čipov je samotná hybridizačná reakcia medzi DNA sondami imobilizovanými na čipe a vzorkou DNA. Podmienky hybridizačnej reakcie (teplota, iónová sila prostredia) musia byť nastavené tak, aby dochádzalo k hybridizácii 100% komplementárnych vláken DNA vzoriek so sondami (próbami), len tak môžu čipy poskytnúť spoľahlivé výsledky.

www odkazy:
DNA Microarray Methodology – Flash animation
Leming Shi DNA Microarray (Genome Chip) – Monitoring the Genome on a Chip
Marc Wortman DNA Chips Target Cancer

Literatúra:
T. Majtan1,*, L. Majtanova2, J. Timko1 and V. Majtan2 Oligonucleotide microarray for molecular characterization and genotyping of Salmonella spp. Strains Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2007 60(5):937-946; doi:10.1093/jac/dkm326

Blaskovic D. and Barák I. (2005) Oligo-chip based assay for detection of tick borne bacteria causing diseases in humans. FEMS Microbiol Letters 243: 473-478.

Kľúčové slová: nanotechnológie, DNA čip, diagnostika génov